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本标准规定了李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot
virus)的检疫鉴定方法。
本标准适用于可能携带李属坏死环斑病毒的植物及其产品的检疫鉴定。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2964 植物病毒检测规范
SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范
学名：Prunus necrotic ringspot virus
缩写：PNRSV
分类地位：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae),等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)。
李属坏死环斑病毒其他信息参见附录 A。
李属坏死环斑病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据
PNRSV 与抗体之
间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA);
依据PNRSV 的基因 组特征建立 RT-PCR、 实时荧光 RT-PCR
检测方法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有
PNRSV。
电子天平(感量0.001
g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80℃)、制
冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH 计、超净工作台、PCR
仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶
成像分析仪、酶标仪。
酶联板、可调移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)和可调移液器头、Eppendorf
管、研钵、微型磨杵等。
GB/T 33114—2016
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682
中相关规定。 DAS-ELISA 试剂
见附录B;RT-PCR 检测试剂见附录C; 实时荧光RT-PCR 检测试剂见附录D。
有病毒为害症状的植物材料单独抽样，PNRSV 的为害症状描述参见附录 A;
无症状的种子、苗木
及其产品抽样方法按照SN/T 2122 中规定执行。
样品制备参照 SN/T 2964 和 SN/T 3457 规定执行。
苗木及其组培苗等产品：有明显症状的，直接取有症状叶片1 g
单独制样，用于后续检测；无明显症
状的，可5株叶片混合采样用于后续检测。
7.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)
把制备的样品上清液加入已包被 PNRSV 抗体的酶联板中，进行 DAS-ELISA
检测。每个样品平 行加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照，感染 PNRSV
的植物组织作为阳性对照，样品提取缓
冲液作为空白对照；其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见
附录 B。
RT-PCR
检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品和对照的总
RNA, 反转录合成cDNA 后进行PCR 检测，具体操作见附录 C。
实时荧光RT-PCR
检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照。分别提取样品
和对照的总RNA, 反转录合成cDNA 后进行实时荧光PCR 检测，具体操作见附录 D。
如采用商品化一
步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：
——首先采用DAS-ELISA 进行初步筛检。
——若检测结果为阳性，采用 RT-PCR
方法进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带 PNRSV。
若验证结果为阴性，则采用实时荧光 RT-PCR 进行进一步验证。若进一步验证的
结果为阴性，则判定样品不携带 PNRSV;
若进一步验证的结果为阳性，则判定样品携带
PNRSV。
——若检测结果为阴性，采用 RT-PCR
方法进行验证，若验证结果为阴性，则判定样品不携带
GB/T 33114—2016
PNRSV; 若 RT-PCR 验证结果为阳性，则需要将PCR
产物进行测序，序列结果相符则判定样 品携带 PNRSV
经检测确定携带PNRSV
的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种苗、叶片等样品保存在
-80℃冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年。
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。
DAS-ELISA 检测应有酶
联反应数值；RT-PCR 检测应有电泳图片和测序结果；实时荧光 RT-PCR
检测应有荧光曲线图。
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(资料性附录)
李属坏死环斑病毒相关资料
A.1 寄主范围
该病毒寄主范围广泛，自然和实验接种侵染21科双子叶植物，该病毒可侵染大多数李属植物，如：
李(Prunus domestrica)、杏(P.armeniaca)、 桃(P.persica)、
樱桃李(P.cerasifera)、 欧洲酸樱桃(P. cerasua)、欧洲甜樱桃(P.avium)、
马哈利酸樱桃(P.mahaleb)、 稠李(P.padus)、 油桃(P.persica var.
nectarina)、野黑樱(P.serotina)、 黑刺李(P.spinosa)
等；该病毒可侵染玫瑰(Rosa rugosa)、啤酒花
(Humulus lupulus)等。在人工接种的情况下还可侵染180余种植物。
A.2 为害症状
病害症状因分离物、栽培种和环境条件不同而不同。病毒的一些分离物不引起症状，仅仅在接种指
示植物或用血清学等方法检测时才能发现被侵染；
一些分离物在系统侵染的当年在幼叶上产生坏死斑
和孔洞，但在以后的年份里，在叶子和果实上很少出现症状；另一些分离物在侵染当年产生坏死反应，随
后是慢性的褪绿叶斑驳和坏死、叶子耳突、畸形、延迟水果成熟，水果上有斑点症状。如在甜樱桃上出现
了无症状到严重皱缩花叶症状，包括叶子上的褪绿点、叶扭曲，水果延迟成熟。在玫瑰上无症状侵染很
普遍，症状有花叶、开花延迟、秋天落叶早、产生更多不成形的花，被侵染的植株通常无活力。在啤酒花
上产生褪绿线和环斑。
A.3 分布地区
广泛分布在温带地区，如欧洲各国和美国都有发生。
A.4 传播方式
机械接种传播、花粉传播、种子传播，也可通过无性繁殖苗木、组培苗等的运输人为途径进行长距离
传播。
A.5 粒体形态
李属坏死环斑病毒粒体为等轴对称球状体，直径23 nm～27
nm,有些粒体为准等轴球状到短棒状
(轴比为1.01～1.5);有些株系的病毒粒体呈明显的棒状(轴比大于2.2);有些棒状粒体达70
nm。 棒状
粒体的有无及比例因株系而异。
A.6 基因组
正单链 RNA,3 分体基因组，RNA-1 长3.662 kb,RNA-2 长2.507 kb,RNA-3
长1.887 kb。
GB/T 33114—2016
(规范性附录)
双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA )
B.1 试剂
B.1.1 包被抗体
特异性的李属坏死环斑病毒抗体。
B.1.2 酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的李属坏死环斑病毒抗体。
B.1.3 底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
B.1.4 1×PBST 缓冲液(pH 7.4)
氯化钠(NaCl) 8.0 g
磷酸二氢钾(KH₂PO₁) 0.2 g
磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 1.15 g
氯化钾(KCl) 0.2 g
吐温-20(Tween-20) 0.5 mL
溶于900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至1000 mL,4℃ 储存。
B.1.5 样品抽提缓冲液(pH 7.4)
亚硫酸钠(Na₂SO₃) 1.3 g
聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP,MW24000～40000) 20.0 g
溶于900 mL 的1×PBST 中，并用1×PBST 定容至1000 mL,4℃ 储存。
B.1.6 包被缓冲液(pH9.6)
碳酸钠(Na₂CO₃) 1.59 g
碳酸氢钠(NaHCO₃) 2.93 g
溶于900 mL 灭菌双蒸水中，并定容至1000 mL,4℃ 储存。
B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4)
牛血清白蛋白(BSA) 2.0 g
GB/T 33114—2016
聚乙烯基吡咯烷酮 (PVP,MW24000～40000)
溶于900 mL1×PBST 中，并用1×PBST
B.1.8 底物缓冲液(pH 9.8)
二乙醇胺
氯化镁(MgCl₂)
定容至1000 mL,4℃ 储存。
溶于800 mL 灭菌双蒸水中，用浓盐酸(HCI) 调 pH 值至9.8,定容至1000 mL,4℃
储存。
B.2 实验步骤
B.2.1 包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100μL。
酶联板加盖或用保鲜膜 包好，37℃孵育2 h。 清空孔中溶液，用1×PBST
加满各孔，3 min 后倒掉孔中溶液，在吸水纸上拍干。
再重复2次上述洗板过程。
B.2.2 样品制备与加样
待测样品按1:10(质量浓度)加入抽提缓冲液，在研钵中研磨；2000 r/min
离心10 min, 上清液即
为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按每孔100μL
分别加入制备
好的检测样品、阴性对照和阳性对照；酶联板加盖或用保鲜膜包好，4℃孵育过夜。酶联板用自来水彻
底冲洗，再用1×PBST 洗涤3次，每次3 min。
B.2.3 加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中，每孔100μL,酶
联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4 h。
酶联板用自来水彻底冲洗，再用1×PBST 洗涤3次，每次
B.2.4 加底物
将底物 pNPP 加入到底物缓冲液中使终浓度为1 mg/mL (现配现用),每孔100 μL
加入到酶联板
中，室温避光孵育。
B.2.5 读数
在不同的时间内如30 min、60 min、90 min、120 min
或更长时间，用酶联仪在405 nm 处 读OD 值 。
B.3 结果判定
B.3.1 质量控制要求
对照孔的 ODos
值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内，即缓冲液孔和阴性对
照孔的 OD 值\<0. 15,当阴性对照孔的 ODos
值\<0.05时，按0.05计算；阳性对照 OD 值/阴性对照
OD 值>5;同一样品的重复性基本一致。
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B.3.2 结果判定
在满足 B.3.1 的质量控制要求后，结果原则上可判断如下：样品 ODs
值/阴性对照 ODos 值 > 2 , 判 为阳性；样品 ODos 值/阴性对照 ODos
值在2左右，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验
证；样品 ODs 值/阴性对照 ODs 值\<2,判为阴性。
若不满足 B.3.1 的质量控制要求，则不能进行结果判断。
GB/T 33114—2016
(规范性附录)
RT-PCR 检测
C.1 试剂
C.1.1 核酸提取试剂
Trizol 或合格的 RNA 提取试剂盒。
C.1.2 电泳缓冲液 TAE(50×)
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸(C₂H₄O₂)
乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA ·2H₂O)
灭菌双蒸水定容至1000 mL, 用时稀释至1×TAE。
242
57.1
37.2
g
mL
g
C.2 检测步骤
C.2.1 核酸提取
称取0.1g 样品加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5 mL
离心管中，加入1 mL 的 TrizoL
试剂，剧烈振荡3 min;4℃ 12000r/min 离心10
min;将上清液移入一新离心管中，加入0.5 mL 氯仿，
猛烈振荡15 s;4℃ 12000 r/min离心15
min;小心吸取上层无色水相到新离心管中；加入等体积异丙
醇，混匀；室温静置10 min;4℃12000r/min 离心10min, 弃上清；加入1 mL75%
的冷乙醇洗涤沉淀；
4℃10000 r/min离心10min, 弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后溶于30μLDEPC-H₂O
中， -20℃保
存备用。
注：此处以0.1 g
样品为例进行核酸提取，实际检测时如样品量有变化，加入的试剂可按比例调整；或者按照商品化
RNA 提取试剂盒进行操作。
C.2.2 引物序列
上游引物 H83:5'-TGGTCCCACTCAGAGCTCAACAAAG-3'
下游引物 C537:5'-ACGCGCAAAAGTGTCGAAATCTAAA-3'
产物大小：455 bp。
C.2.3 反转录
反应体系：20μL;在0.2 mLPCR 管中加入总 RNA 1μL,dNTPs(10
mmol/L)1μL,DEPC-H₂O
10μL,引物 C537(20μmol/L)2μL,70℃ 保温5 min; 冰上放置5 min; 再加入5×反转录
buffer 4 μL,
RNasin(40 U/μL)1μL,M-MLV(200 U/μL)1μL,42℃保 温 1h,得到 cDNA 后用作 PCR
的模板。
C.2.4 PCR 扩增
反应体系：20μL;在0.2 mLPCR 管中加入10×PCR buffer(含 Mg²+)2μL,dNTPs(10
mmol/L)
GB/T 33114—2016
0.6μL,正向引物及反向引物(均为20 μmol/L) 各0.5μL,Taq 酶(2
U/μL)1μL,模板2μL 和 DEPC-
H2O13.4μL。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。
反应程序：94℃ 40 s;60℃ 1 min;72℃1min;35 次循环；72℃ 10 min。
注：如采用商品化一步法 RT-PCR
检测试剂盒，可按照说明书进行操作，将步骤C.2.3和 C.2.4合并进行。
C.2.5 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和 PCR 扩增产物，用DNA
Marker 作为分子
量标记，进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性 DNA
条带，并拍摄
记录。
C.3 结果判定
阳性对照在455 bp
左右处有条带，阴性对照和空白对照无特异性条带，待测样品出现与阳性对照
一致的条带，判定为阳性。
阳性对照在455 bp
左右处有条带，阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带，判定结果为
阴性。
GB/T 33114—2016
(规范性附录)
实时荧光 RT-PCR 检测
D.1 试剂
核酸提取试剂同C.1.1。
Taq Man One-step RT-PCR Mixture。
D.2 引物探针
上游引物 PNRSV-F:5'-AATGCCCTGTCTAGGAAGGGGTT-3'
下游引物 PNRSV-R:5'-CGCAAAAGTGTCGAAATCTAAATC-3'
探针 PNRSV-Probe.5'-FAM-GGTTCTTGAAGGACCAACCGAGAGG-TAMRA-3'
D.3 核酸提取
方法同 C.2.1。
D.4 实时荧光 RT-PCR 反应
反应体系：0.2 mL 离心管中加入2×One Step RT-PCR BufferⅢ 10 μL,Ex TaqHS(5
U/μL) 0.4 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL,PNRSV-F(10 μmol/L)0.4
μL,PNRSV-R
(10 μmol/L)0.4 μL,PNRSV-Probe(10 μmol/L)0.6 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4
μL,模板 RNA
2μL,补 DEPC-H₂O 至20μL。设置阳性对照、阴性对照及空白对照。
反应程序：42℃ 10 min;95℃ 10 s;95℃ 15 s,62℃1min,共45个循环。
D.5 结果判定
在空白对照及阴性对照无 Ct 值且无扩增曲线、阳性对照 Ct
值≤30并出现典型扩增曲线的条
件下：
待测样品的Ct 值≥40时，判定PNRSV 阴性。
待测样品的Ct 值≤35时，判定PNRSV 阳性。
待测样品的Ct 值小于40而大于35时，应重新进行测试；如果重新测试的Ct
值≥40,判定PNRSV
阴性；如果重新测试的Ct
值小于40而大于35,且分离曲线明显时，则判定结果为阳性。
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